凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assays,EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术。这项技术是基于DNA/蛋白质复合物在非变性聚丙烯凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳中有不同迁移率的原理。当DNA结合蛋白与其相应的DNA结合序列结合后，其在凝胶中的迁移率将小于未结合蛋白的DNA，从而检测到活化的与DNA结合的蛋白转录或调节因子。该技术使得研究者可以从不同的核提取物或基因启动子中筛选出特定的具有DNA结合活性的转录因子。
图1 EMSA实验原理 图2 EMSA结果示例
● Biotin标记的DNA = 无细胞裂解液或纯化蛋白因子，凝胶电泳不发生迁移
● Biotin标记的DNA + 提取物= 蛋白结合到标记的DNA探针上，凝胶电泳发生迁移
● Biotin标记的DNA + 提取物+ 过量的未标记 DNA = 无迁移，过量的未标记的DNA竞争性结合提取物中的目标蛋白；这个反应用于验证蛋白-DNA的特异性相互作用。
● Biotin标记的DNA + 提取物+ 过量的未标记 DNA = 无迁移，过量的未标记的DNA竞争性结合提取物中的目标蛋白；这个反应用于验证蛋白-DNA的特异性相互作用。
Active motif公司提供的Gelshift™化学发光法EMSA试剂盒，是一种简单、非放射性的试剂盒，可用于研究蛋白-DNA的相互作用。该试剂盒提供实验所需的所有试剂，包括biotin标记和未标记的对照DNA以及对照裂解液。细胞裂解液或纯化的蛋白样本与3’或5’端Biotin标记的含目的蛋白特异结合序列的DNA探针混合孵育，混合物经非变性聚丙烯凝胶电泳后转移至尼龙膜上。使用streptavidin-HRP结合biotin标记的探针，加入化学发光底物检测，和目的DNA结合的蛋白在迁移率上小于未结合蛋白的DNA，形成一个“迁移”条带。
Gelshift™化学发光法EMSA试剂盒的特点
● 非放射性检测；
● 和放射性标记或地高辛标记相比，灵敏度更高；
● 操作快速，5小时内即可完成实验；
● 提供附加的试剂，对于不同的样本可进行最佳实验条件的优化；
● 提供对照DNA和提取物，可以帮助初次使用者进行实验，并理解用于确定特异结合相互作用的方法。
● 和放射性标记或地高辛标记相比，灵敏度更高；
● 操作快速，5小时内即可完成实验；
● 提供附加的试剂，对于不同的样本可进行最佳实验条件的优化；
● 提供对照DNA和提取物，可以帮助初次使用者进行实验，并理解用于确定特异结合相互作用的方法。
图3 Gelshift™化学发光法EMSA试剂盒具有更好的灵敏度
HeLa细胞核提取物（6.8µg ）分别使用Gelshift™化学发光法EMSA试剂盒、地高辛EMSA试剂盒和放射性P32的EMSA试剂盒与相应标记的20fmol的Oct-1双链DNA混合孵育，按照各厂家的操作手册进行EMSA实验。对于放射性EMSA，凝胶直接曝光于X-ray胶片。
图4 使用Gelshift™化学发光法EMSA试剂盒能高灵敏检测到感兴趣的DNA-蛋白复合物
使用Gelshift™化学发光法EMSA试剂盒高灵敏检测到4种不同的DNA-蛋白复合物。Biotin标记的目标DNA与LeLa细胞核提取物(Oct-1, AP1 和NFκB) 或试剂盒里的阳性对照核提取物（EBNA）混合孵育。未标记的竞争DNA使用的摩尔浓度是标记的靶序列DNA的200倍。EBNA对照反应中添加了2.5%的甘油和0.05% NP-40，AP1反应中添加了10%的甘油。X-ray胶片曝光时间分别为2分钟（EBNA Control，Oct-1 ，AP1）和5分钟（NFκB ）。
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供应商
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产品编号
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产品名称 |
规格
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Active Motif
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37341
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Gelshift™ Chemiluminescent EMSA 试剂盒组成： 10×结合缓冲液 生物素-EBNA对照DNA 未标记的ENBA对照DNA ENBA对照核提取物 Poly d(I-C) 50%甘油 1%NP-40 1M 氯化钾 100mM 氯化镁 200mM EDTA，pH8.0 5×上样缓冲液 辣根过氧化物酶标记的链亲和素 鲁米诺化学发光底物 反应缓冲液 封闭缓冲液 4×洗涤缓冲液 底物平衡缓冲液 |
100 rxns
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1ml
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50ul
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50ul
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125ul
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125ul
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500ul
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500ul
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1ml
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500ul
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500ul
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1ml
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1.5ml
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80ml
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80ml
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500ml
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500ml
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500ml
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| 其他相关产品 |
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供货商
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产品编号
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产品名称
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规格
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用途
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Vectorlabs
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MB-9002
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3’ EndTag™ Kit
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1 Kit
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DNA的3‘端生物素标记
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Vectorlabs
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SP-1501
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Biotin Maleimide
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12 mg
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Active Motif
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40010
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Nuclear Extract Kit
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100 rxns
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核蛋白提取
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Millipore
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INYC00010
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Immobilon-NY+ 30cm x 3m Roll Charged Nyl
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30cm x 3m
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带正电荷尼龙膜
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参考文献
