福尔马林固定、石蜡包埋（Formalin-fixed paraffin-embedded ，FFPE）组织块和组织切片是临床样本回顾性研究中非常有价值的资源。通过研究FFPE样本，研究者可以将FFPE样本中的信息和疾病、诊断以及标志物的发现关联起来。然而使用FFPE样本仍然具有很多挑战，这些样本一般体积很小，而且福尔马林固定的过程缺乏一致性，常常由于过度固定或者保存时间过长导致抗原的丢失。基于以上原因，FFPE样本很少用于ChIP实验中。
Active motif公司基于在ChIP方面的专长，首次开发出商品化的可用于福尔马林固定、石蜡包埋组织样本的ChIP试剂盒用于二代测序。ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation Kit包含特殊试剂和操作指南，用于从组织切片中提取高质量的染色质。由于从FFPE样本中提取的染色质产量很低，必须使用ChIP-IT® FFPE染色质免疫共沉淀试剂盒，该试剂盒是唯一的可用于有限染色质转录因子或组蛋白富集的ChIP试剂盒，在保证最低背景信号的同时，能提供较高的灵敏度。
ChIP-IT® FFPE 的优势
● 可以从病例切片或者石蜡包埋组织块等起始样本中提取高质量的染色质
● 可以从ng级的FFPE染色质样本中高灵敏富集DNA
● 优化的试剂可以降低非特异结合造成的背景
● 和磁珠捕获的方法相比，离心过滤洗涤的方法更快更简单，并且可以更好的保持结果的一致性
● 严格验证的操作步骤，从正常或肿瘤组织FFPE切片中提取的染色质可用于qPCR和ChIP-Seq 分析
● 染色质制备试剂盒和ChIP试剂盒都包含对照，有利于结果的验证
Active motif公司基于在ChIP方面的专长，首次开发出商品化的可用于福尔马林固定、石蜡包埋组织样本的ChIP试剂盒用于二代测序。ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation Kit包含特殊试剂和操作指南，用于从组织切片中提取高质量的染色质。由于从FFPE样本中提取的染色质产量很低，必须使用ChIP-IT® FFPE染色质免疫共沉淀试剂盒，该试剂盒是唯一的可用于有限染色质转录因子或组蛋白富集的ChIP试剂盒，在保证最低背景信号的同时，能提供较高的灵敏度。
ChIP-IT® FFPE 的优势
● 可以从病例切片或者石蜡包埋组织块等起始样本中提取高质量的染色质
● 可以从ng级的FFPE染色质样本中高灵敏富集DNA
● 优化的试剂可以降低非特异结合造成的背景
● 和磁珠捕获的方法相比，离心过滤洗涤的方法更快更简单，并且可以更好的保持结果的一致性
● 严格验证的操作步骤，从正常或肿瘤组织FFPE切片中提取的染色质可用于qPCR和ChIP-Seq 分析
● 染色质制备试剂盒和ChIP试剂盒都包含对照，有利于结果的验证
图1 ChIP-IT® FFPE染色质免疫共沉淀试剂盒操作流程
使用ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation Kit (货号53030)从FFPE组织块或组织切片中制备染色质。加入特异的DNA结合蛋白抗体进行孵育，使用Protein G 琼脂糖珠捕获抗体-DNA结合蛋白/DNA复合物，经过重力过滤洗涤后，将复合物解交联，蛋白酶K消化结合蛋白，收集DNA。ChIP富集的DNA可用于二代测序或全基因组测序。
图2 qPCR分析使用ChIP-IT FFPE 试剂盒从正常人和肿瘤结肠组织中富集的DNA片段
使用ChIP-IT FFPE Chromatin Preparation试剂盒从保存10年的正常人和肿瘤结肠组织FFPE切片中制备染色质。取250ng正常人组织染色质和185ng肿瘤组织染色质，使用组蛋白H3K4me3抗体和转录因子YY1抗体，用ChIP-IT® FFPE试剂盒进行ChIP实验，富集的DNA使用ChIP-IT qPCR Analysis Kit（货号53029）进行分析。H3K4me3的结果显示在某些肿瘤中GAPDH的表达是上调的。数据表示每1000个检测细胞中所检测到富集结合情况，代表三次重复实验所得原始数据的均值。
由于PPFE样本的固定和保存条件差异很大，因此不是所有的PPFE样本都能获得高质量的染色质。因样本的限制，经常有必要从多张组织切片中制备染色质用于后续的ChIP实验。ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation试剂盒提供足够的试剂和详细的操作步骤，每次可从10张组织切片中至少制备出200ng用于ChIP实验的染色质。在制备过程中，每个PPFE样本的操作方法可能不一样，甚至因为固定方法的不同，即使相同的组织，在匀浆和超声的过程中也会遇到不同的困难。
图3 使用ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation Kit 从FFPE组织切片中制备染色质的操作流程
使用ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation Kit，从10-20 µm的FFPE组织块，或者未染色的5-10 µm的FFPE组织切片中提取染色质。每次可同时从多达10张切片中提取足量的染色质用于后继的ChIP实验。每张片子经过脱蜡和再水化处理，加入裂解缓冲液，经匀浆处理后超声破碎30秒，再用酶切混合物消化处理。离心收集裂解物混合到同一管里进行超声处理；离心，qPCR分析制备的染色质。
| issue type | Sample used per chromatin preparation |
| Human Colon | Tissue block – five 20 µm sections |
| Human Kidney | Tissue block – twenty-five 20 µm sections |
| Human Lung | Tissue block – two 20 µm sections |
| Rat whole brain | 5 slides – two 5 µm sections |
| Rat hippocampus |
25 slides – two 5 µm sections |
图4 成功用于ChIP-IT® FFPE的福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的样本类型及所用的切片数量
由于从PPFE样本中制备的染色质含量比较低，因此不推荐用凝胶电泳分析，而是用qPCR。ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation试剂盒包含DNA standards 和 PCR primers，可对从PPFE样本中制备的染色质进行qPCR定量分析，同时也可以验证是否为可溶性的染色质来用于下游的ChIP。如有必要，可对染色质进行重复的超声处理以增加其可溶性及产量。
由于从PPFE样本中制备的染色质含量比较低，因此不推荐用凝胶电泳分析，而是用qPCR。ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation试剂盒包含DNA standards 和 PCR primers，可对从PPFE样本中制备的染色质进行qPCR定量分析，同时也可以验证是否为可溶性的染色质来用于下游的ChIP。如有必要，可对染色质进行重复的超声处理以增加其可溶性及产量。
图5 人肾脏FFPE组织样本来源的染色质可溶性分析
使用ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation试剂盒从2组（A和B）保存10年的正常人肾组织（标记为N）和肿瘤组织（标记为T）切片中制备染色质。每个样本重复2次。使用阳性对照GAPDH-2引物和DNA Standards对可溶的和不可溶的染色质片段进行qPCR定量分析。上图显示仅从B组的肿瘤组织获得了较高产量的可溶性染色质。从B组正常组织以及A组正常组织和肿瘤组织中制备的不溶性沉淀，用ChIP buffer稀释到终体积1ml，进行第二次超声处理。取25ul的可溶性和非可溶性部分进行解交联，蛋白酶K消化处理，使用GAPDH-2引物和DNA Standards进行qPCR分析。结果表明可溶性的染色质含量仍然很低，但混合两次制备的可溶性染色质，含量足够用于ChIP分析。
参考文献
1.Weng, L. et al. (2010) J Pathol., 222: 41-51.
2.Gu, H.., et al. (2010) Nat. Methods, 7: 133-136.
3.Fanelli, M. et al.(2010) PNAS, 107(50): 21535-21540.
4.Fanelli, M. et al.(2011) Nat. Protocols, 6(12): 1905-1919.
产品订购信息
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供应商
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产品编号
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产品名称
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规格
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Active Motif
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53045
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ChIP-IT® FFPE
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16 rxns
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Active Motif
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53030
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ChIP-IT® FFPE Chromatin Preparation Kit
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5 rxns
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Active Motif
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53029
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ChIP-IT® qPCR Analysis Kit
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10 rxns
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