DNA甲基化检测（重亚硫酸盐处理）试剂盒

DNA甲基化是一种基本的表观遗传学修饰，在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用。在DNA甲基转移酶的催化下，CpG双核苷的胞嘧啶第5 位碳原子被选择性地添加甲基基团。在人类肿瘤中，普遍发生甲基化异常的现象，由于甲基化与胚胎发育、细胞周期调控相关，因此DNA甲基化状态的变化可作为疾病诊断和预后的一个有用的指示器。

最早在1970年，重亚硫酸盐转化就被用于鉴别DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶（5-mC）。现在认为在重亚硫酸盐处理过程中，5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）都不会发生碱基的变化，因此这种方法不能用来区别不同的甲基化修饰。在重亚硫酸盐转化过程中，DNA首先用重亚硫酸钠处理，在高温和低pH条件下，将变性DNA（单链DNA）中的胞嘧啶转化为胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物，这个反应是可逆的；接下来胞嘧啶-重亚硫酸盐衍生物发生不可逆的水解脱氨基过程，形成尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物。最后在高pH条件下尿嘧啶-重亚硫酸盐衍生物脱磺酸基形成尿嘧啶。只有未甲基化的胞嘧啶在重亚硫酸盐处理下发生碱基变化， 5-mC和5-hmC仍然保持不变。转化处理后的DNA经PCR扩增，尿嘧啶（U）转变为胸腺嘧啶（T）。重亚硫酸盐转化示意图如下：

图1 重亚硫酸盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶

Active motif公司的Bisulfite Conversion Kit提供优化的转化试剂、简单易用的操作步骤以及阳性对照PCR引物，简化了DNA甲基化检测的过程。整个转化可在1.5小时之内完成，转化效率高达99%。试剂盒提供转化特异性PCR引物，可用于测序前验证重亚硫酸盐转化效率。阳性对照PCR引物适用于重亚硫酸盐转化处理的人和小鼠DNA，经PCR扩增可得到220 bp的产物。
Active motif同时也提供MethylDetector™重亚硫酸盐修饰试剂盒，该试剂盒是Active motif公司最初提供的一款DNA甲基化检测试剂盒，原理和Bisulfite Conversion Kit一样，但转化时间需要5小时。

图2 Bisulfite Conversion Kit 操作流程

使用Bisulfite Conversion Kit，将目的DNA用蛋白酶K处理，加入重亚硫酸盐转化试剂和DNA变性剂，在温度循环仪中进行快速热变性。经过1.5小时的DNA转化反应，样品加入到试剂盒里的DNA纯化柱，脱盐后洗脱DNA，可用于PCR或其他的下游实验。

图3 阳性对照转化特异性PCR引物可用于特异性扩增转化后的人和小鼠DNA

使用Bisulfite Conversion Kit处理人（A）和小鼠（B）基因组DNA，处理（Bis）和未处理（Untr）的DNA分别用阳性对照转化特异性PCR引物进行PCR扩增分析。阳性对照PCR引物专门适用于经重亚硫酸盐转化的DNA，因此会扩增出220bp的条带，而未处理的DNA没有扩增出相应条带。

产品信息

供货商	产品编号	产品名称	规格
Active Motif	55016	Bisulfite Conversion Kit	50 rxns
Active Motif	55001	MethylDetector™	50 rxns
Active Motif	55003	Fully Methylated Jurkat DNA	10 µg
Active Motif	55007	Jurkat genomic DNA	10 µg

参考文献
1.“Aberrant methylation of the PTCH1 gene promoter region in aberrant crypt foci.” by Peng L. et al. (2013) Int J Cancer, 132(2): E18-25.
2. “Transcription intermediary factor 1γ is a tumor suppressor in mouse and human chronic myelomonocytic leukemia.” by Aucagne R. et al. (2011) J Clin Invest., 121(6): 2361-2370.
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5. “Cerebellum-specific and age-dependent expression of an endogenous retrovirus with intact coding potential.” by Lee K.H. et al. (2011) Retrovirology, 8: 82.