图一
1.固定特异性单克隆抗体在96孔ELISpot板上。
2.分别加入有特异性刺激因子和无刺激因子的细胞。
3.孵育过程中，细胞被刺激因子激活开始分泌细胞因子，细胞因子和单克隆抗体结合。
4.移除细胞，加入交联生物素或酶的检测单克隆抗体。
5.如果使用交联生物素的单克隆抗体检测，加入链霉亲和素酶联物。
6.最后，加入底物，细胞分泌位点会形成有色斑点。
7.计算实验组和对照组斑点数量。



ELISpot是迄今为止细胞分析最敏感的方法之一，它以细胞因子为分析对象，比传统的ELISA方法敏感20-200倍。ELISpot和RT-PCR敏感性相当，不同的是ELISpot检测的是分泌蛋白而不是mRNA。 ELISpot分析细胞因子有很大优势，细胞因子分泌后可立即被连接到捕获抗体上，因此很少会被结合蛋白和活性蛋白酶破坏。ELISpot具有较高的灵敏性，特别适用于细胞因子含量较低时的检测，例如特异性免疫反应的定期检测等。

应用
ELISpot分析方法被广泛应用于感染引起的特异性免疫反应、癌症、过敏、自身免疫疾病。它是研发和检测新疫苗和候选疫苗的标准方法。ELISpot通过细胞因子分析也能用来鉴别T细胞的亚型，例如，Th1细胞产生IFN-γ、IL-2 和TNF-α，而Th2细胞产生IL-4、IL-5 和 IL-13。ELISpot既可以进行单个实验也能进行大规模试验。和四聚体法（检测细胞毒性T淋巴细胞反应）相比，进行大规模试验时ELISpot不许需要提前表位鉴定和MHC-Ⅰ型限制。对实验设备要求比较低，适合于实地研究。随后，以ELISpot为平台的诊断测试也相继出现，它通过检测结核杆菌抗原刺激T细胞后的分泌物IFN-γ判断病人是否感染结核或携带者。ELISpot比皮肤测试有更高的灵敏性和特异性，不会混淆之前接种的BGC疫苗。ELISpot可以应用于许多物种，除了人、猴子、小鼠、大鼠细胞之外，还可应用于兽医学，评价牛、羊、马、猪来源的T细胞反应。

疫苗开发
IFN-γ ELISpot被应用于许多大规模试验用于监测HIV候选疫苗，评价HIV疫苗和其它病原体及肿瘤疫苗（见图2）。ELISpot还可检测疫苗的功效，从而评估疫苗的设计方法是否合适。除了可以检测IFN-γ，ELISpot还可检测其它细胞毒性关键因子，例如：穿孔蛋白、颗粒酶B。

图2.肽刺激T细胞后用ELISpot分析人IFN-γ。CD8+ T用来源于病毒的MHC-Ⅰ型限制肽刺激16小时，同时设置阴性对照（不刺激）。


过敏反应
ELISpot可应用于过敏研究，过敏研究中的Th2反应至关重要，但是反应频率比较低，因此就需要高灵敏的方法来检测Th2反应。ELISpot还可在特异性免疫治疗中监测T细胞反应，开发体外诊断测试方法等。ELISpot常用于检测IL-4，IL-4是Th2型反应的主要细胞因子，用流式和ELISA检测时常常由于灵敏性低导致实验失败（见图3）。

图3.外周血单核细胞对镍体外过敏反应。斑点测试反应显示+++ (n=10), ++ (n=11), + (n=10) , 0 (controls; n=10)。单核细胞中加入50 μM NiCl2孵育40小时，31个过敏个体用ELISpot可检测到23个，而ELISA只检测到4个阳性反应。


其它类型细胞分析
最初，ELISpot用于计算细胞分泌的特异性抗体。近几年，B细胞ELISpot的发展，使ELISpot技术得以复苏，主要用于检测B细胞感染反应和疫苗引起的感染。
从理论上讲，ELISpot可以应用于任何单细胞水平的检测。例如脂多糖刺激外周血单核细胞分泌的IL-1β和 IL-6定量研究（见图4.）。还可用于少数细胞的研究，例如浆细胞样树突状细胞，它在血液中的出现频率很低，但用ELISpot可以很容易检测到它的产物IFN-α。

图4. ELISpot分析脂多糖刺激人外周血单核细胞后分泌的IL-1β 和 IL-6。加入脂多糖(100ng/ml)后孵育细胞(5,000 cells/well)20小时，设实验组和对照组。

技术

试验方法优化
ELISpot方法有几个关键步骤，高特异性抗体选择是最重要的一步，其它关键参数包括ELISpot板的选择、包被程序等。包被前PVDF板用乙醇处理，可以增加联接捕获抗体的能力。事实上，不同的板子对乙醇的反应也不一样，因此选择合适的方法很关键。如果乙醇处理恰当，斑点的质量和数量比未经乙醇处理的要好很多。值得注意的是，过度乙醇处理（乙醇体积过大或时间过长）会降低实验效率（见图5）。
捕获抗体一般推荐15μg/ml（100μl/well），如果捕获抗体浓度小于15μg/ml，斑点会呈弥散状，影响后续计算。在许多细胞因子ELISpot实验中，捕获抗体数量越少，斑点的损失就越大。因此，设计试验时要考虑到捕获抗体的数量，尤其是生成细胞频率较低或细胞因子数量较少时。
最后一步加入沉淀底物，不同的酶(ALP或HRP)使用不同的底物，不同的底物产生不同的颜色，而且灵敏度也不一样（见图6）。一般情况下，我们推荐ALP 使用BCIP/NBT；HRP 使用TMB。这两种酶的灵敏性非常好，都可以产生清晰的斑点。

图 5. 包被前乙醇处理MSIP对结果的影响，Mabtech预包被板的比较。用CEF肽刺激人的外周单核细胞(250,000 cells/well)，然后检测IFN-γ产量。

图6. ELISpot通用底物。不同的酶(ALP 或 HRP)交联不同的底物。以IFN-γ ELISpot为例，ALP使用BCIP/NBT，HRP 使用TMB 和AEC。