LIF(白血病抑制因子)的前世今生

LIF的英文全称为Leukemia Inhibitory Factor，中文译为白血病抑制因子，其为一种具有多种功能的细胞因子，但其最重要的应用是维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态。为帮助您更好的选择和使用LIF，特与大家分享此文。

LIF是如何发现的？

LIF从发现、克隆到现在(2013年)已经有25年的历史了，与PeproTech公司同龄(PeproTech公司成立于1988年，今年是其25周年庆)。
那么LIF是如何被发现的呢？这要从白血病的治疗说起 ----
我们知道，正常的血液细胞是终末分化的细胞。存在于骨髓或外周血等处的微量造血干/祖细胞经过增殖和分化后可成为成熟的血液细胞，以不断补充死去的成熟血液细胞。如果造血干/祖细胞的增殖、分化过程受到异常调节，这些细胞将停留在幼稚的细胞阶段，而数目仍在不断增加，这就是白血病的成因。因此，白血病是造血细胞的增殖和分化过程失去正常的控制而形成的。科学家一直在寻找能够促进白血病细胞分化，同时又能抑制其增殖的细胞因子或药物，以期治疗白血病[1]。

19世纪80年代已发现了一些调节造血细胞增殖和分化的细胞因子，如G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)，Multi-CSF(即现在的IL-3)和IFN-g(干扰素- g)等。这些细胞因子的共同特点是：既能促进造血细胞的分化，又能刺激它们的增殖。这就带来一个问题，即这些细胞因子在促进白血病细胞分化的同时，也会大量增加白血病细胞的数量，这样可能会加重白血病的病情，而不是治疗白血病。所以，科学家试图仍然需要找到一种只诱导白血病细胞分化，但不促进白血病细胞增殖的细胞因子来治疗白血病。

1969年在从SL品系小鼠的自发髓系白血病体外建系(即后来我们所熟知的小鼠M1髓系白血病细胞系，常用于重组LIF蛋白的生物活性检测)的过程中，研究人员发现，正常细胞的培养液可诱导M1白血病细胞系分化为成熟的巨噬细胞或粒细胞。研究人员将培养液中的这些未知的诱导成分统称为Differentiation Stimulating Factor, 即分化刺激因子，简称D-factors (D-因子)[2]。

1981年[3]年和1984年[4]科学家分别从小鼠Krebs肉瘤细胞和小鼠 L929成纤维细胞的培养液中鉴定出MGI-2(Macrophage and Granulocyte Inducing-2, 巨噬细胞和粒细胞诱导-2)和一种D-因子，两者均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞的分化，而不刺激正常造血细胞的增殖。

紧接着在1987年，澳大利亚皇家墨尔本医院沃尔特与伊丽莎医学研究所(Walter and Eliza Hall Institute (WEHI), Royal Melbourne Hospital)的Donald Metcalf实验室从小鼠Krebs肉瘤细胞培养液中分离出可以诱导小鼠M1髓系白血病细胞分化的蛋白，因该蛋白具有抑制M1髓系白血病细胞增殖的作用，因而被命名为白血病抑制因子，即Leukemia Inhibitory Factor (LIF)。同时发现，该蛋白不能刺激正常髓系前体细胞的增殖。 Donald Metcalf等认为LIF与前面所发现的MGI-2和D-因子是同一种物质，因他们最大的共同点是均可诱导小鼠M1髓系白血病细胞向巨噬细胞分化。至此，LIF蛋白被正式发现和命名，MIG-2和D-因子为其别名。随后，Donald Metcalf实验室分别于1987年和1988年克隆出表达小鼠LIF和人LIF的基因[5,6]。

LIF的发现似乎给人们治疗白血病带来希望。然而深入的研究发现，LIF的作用非常广泛，即使对于白血病细胞系，也是有些抑制，有些促进。因此，LIF与其它多功能的细胞因子，如TNF-a等相似，很难应用于临床。这些年来，LIF颇受关注。血液学家、神经生物学家、肌肉细胞生物学家、骨生物学家、内分泌生物学家和生殖生物学家都在研究LIF，可惜没人能够做深[7]。LIF目前最广泛的应用还是在实验室里用来培养小鼠胚胎干细胞，这在后面会详述。

LIF怎么和小鼠胚胎干细胞（Murine Embryonic Stem Cell,mES）的培养联系上的呢？

LIF因为可抑制小鼠M1白血病细胞的增殖而得名，那么科学家又是如何发现其在mES培养中的重要作用呢？科研充满了巧合，但需要敏锐和发散性的思维去感触这种巧合。

1981年剑桥大学的Martin Evans，Matthew Kaufman和美国加州大学旧金山分校(UCSF)的Gail Martin等首先从小鼠胚胎内细胞团(Inner Cell Mass, ICM)中获得小鼠胚胎干细胞(mES)[8,9]的时候，必须在饲养层细胞(feeder cells)上进行培养，否则mES就会自发分化。

为分析饲养层细胞抑制mES分化的机制，人们从饲养层细胞的培养上清中分离出能够抑制mES分化的成分[10,11]。但这些成分的抑制分化作用均弱于英国爱丁堡大学医学院(University of Edinburgh Medical School)的Austin Smith于1986年从Buffalo大鼠肝脏细胞培养上清中分离出来的DIA(differentiation-inhibiting activity)，即分化抑制活性蛋白[12]。后来，Austin Smith转到英国牛津大学工作，并继续研究DIA。1988年与美国Genetics Institute公司合作，Austin Smith在探讨DIA是否可作用于ES细胞以外的细胞时，发现DIA能够维持DA-1a (小鼠IL-3依赖的白血病细胞系)的持续生长[13]。凑巧的是，美国Genetics Institute公司新近刚克隆出一个能维持DA-1a细胞生长的造血生长因子基因，命名为HILDA(Human Interleukin for DA cells)。更重要的是，序列分析发现，HILDA基因与澳大利亚Donald Metcalf实验室于同一年刚刚克隆出来的人LIF(hLIF)基因[6]序列一致，也就是说HILDA就是LIF[14]。美国Genetics Institute公司的这两个工作连续发表在Nature杂志1988年的同一期中。

鉴于DIA和HILDA/LIF均能够维持DA-1a的生长，Austin Smith就在想，HILDA/LIF是否也能和DIA一样能够抑制mES的分化。结果是令人振奋的！即将HILDA/LIF基因克隆进入非洲绿猴COS肾细胞中进行表达，COS细胞的培养上清可抑制mES细胞的分化。而且，考虑到DIA蛋白与HILDA/LIF蛋白的分子量也相近。因此推测，DIA应该就是LIF[13]。

上面的研究最重要的是发现了LIF可能就是能够抑制mES分化的DIA，也揭示了LIF对不同细胞系具有不同的作用，甚至是截然相反的作用。对小鼠M1白血病细胞，LIF可促进其分化，而对于mES，LIF则抑制其分化。

估计国外科学家之间的沟通是非常多和及时的。同期，发现小鼠和人LIF的澳大利亚Donald Metcalf实验室也敏锐地意识到DIA与LIF的相似性，并证实LIF(无论是人LIF，还是小鼠LIF)能维持mES的未分化状态[15]，该研究结果与美国Genetics Institute公司的两个工作发表在1988年Nature杂志的同一期上。也就是说，Nature杂志1988年的同一期连续刊登了3篇关于LIF的文章，且都是讲LIF与mES细胞培养的关系，可见LIF在mES细胞培养中的重要性。

因此在1988年底，也就是人的LIF刚刚被克隆出来的时候，人们就将目光转向了LIF在mES培养中的作用。此后，没人再去验证DIA与LIF是否真为同一种物质，因只要得到了一种能够强力抑制mES分化的因子(即LIF)就足够了。

培养mES(小鼠胚胎干细胞)，应该用人的LIF(human LIF, hLIF)，还是小鼠的LIF(murine LIF, mLIF)?

培养mES究竟是应该用mLIF，还是hLIF，要从以下三个方面来考量：

1) 性能
hLIF和mLIF的发现者--澳大利亚Donald Metcalf实验室研究证实，hLIF对小鼠M1髓系白血病细胞的诱导分化能力与mLIF相同或更好[6]，也就是说hLIF完全可以替代mLIF来培养小鼠细胞。

更重要的是，1988年Donald Metcalf在Nature上馔文专门比较了hLIF和mLIF在维持mES细胞未分化状态的能力，发现两者完全一致，且最适用量均为1000 units/ml[15]。

有趣的是，hLIF可完全替代mLIF作用于小鼠细胞，但反过来，mLIF却对人的细胞无效。这是什么原因呢？

研究表明，hLIF可与小鼠细胞上的mLIF受体(mLIF-R)结合，且亲合力高于mLIF与mLIF受体的结合，这可能是hLIF对小鼠M1髓系白血病细胞的诱导分化能力比mLIF更好的原因。而mLIF不能与人细胞上的hLIF受体(hLIF-R)结合。所以mLIF不能用于培养人的细胞[16]。

综上所述，hLIF和mLIF在培养mES上的性能完全相同，可以相互替代，也就是说，完全可用hLIF来培养mES。

2) 价格
hLIF和mLIF的价格相差很大，主要原因是mLIF属于专利产品，为一家公司独有，其价格要高出hLIF 2-3倍之多。

Donald Metcalf等发现mLIF和hLIF，以及后期有关LIF的研究工作都是在澳大利亚AMRAD公司的资助下进行的，因此在后来申请专利时，发明者(Inventors)是Donald Metcalf实验室的人员，但受让人(Assignee，即专利的持有者)是澳大利亚AMRAD公司。后来，AMRAD公司自己在研制LIF药物，而将mLIF的专利权授权给另外一家公司仅用于科学研究。

从表1中可以看出，hLIF比mLIF便宜很多，且有大包装以及无动物成分(Animal Free)的hLIF可供选择，因此从性价比考虑，培养mES最好用hLIF。

表1：人LIF和小鼠LIF的比较
	hLIF (人LIF)	mLIF (小鼠LIF)
氨基酸数目	180	180
氨基酸序列一致性	78%
分子量(非糖基化)	19.6kD	20kD
糖基化程度	非常高
糖基化与生物活性的关系	无
生物学活性	对人和小鼠细胞的生物学活性完全相同	仅能作用于小鼠细胞
培养mES的工作浓度	1,000 units/ml 或10ng/ml
价格	以PeproTech公司的hLIF为例 (产品编号：300-05)：	专利拥有公司的产品编号分别为LIF2005和 LIF2010：
	960元/5ug	2071元/5ug
	2340元/25ug 9,800元/100ug	3077元/10ug 12,987元/ESG1107
大包装	有250ug, 500ug和1mg等其它大包装供选择。包装越大，相对单位成本越低。	无
无动物成分蛋白	有，产品编号为AF-300-05	无

3) 与其它动物的交叉反应
我们知道，目前商品化的LIF以人和小鼠为主，其它种属的LIF很难买到。因此，如果您除了研究小鼠的ES(胚胎干细胞)或iPS(诱导多能干细胞)，同时还研究其它动物，如牛、猪、犬、羊的ES或iPS，则不得不选用hLIF或者mLIF。

究竟是应该用hLIF，还是mLIF呢？国际上的标准是根据hLIF和mLIF与其它种属动物LIF的同源性高低来确定。表2显示，hLIF与牛、猪、犬、羊的LIF的氨基酸序列一致性均明显高于mLIF，因此国际上通常用hLIF来培养这些动物的ES或iPS[17-20]。

表2：人LIF和小鼠与其它种属LIF的氨基酸序列一致性
	hLIF (人LIF)	mLIF (小鼠LIF)
牛(Bovine)	88%	76%
猪(Porcine)	87%	78%
犬(Canine)	91%	80%
羊(Sheep)	89%	77%

总而言之，从性价比以及与其它种属的交叉反应来考虑，用hLIF是明智的选择。

奇怪的现象：hLIF对mES有效，而对hES(human ES，即人ES)的培养无效?

ES细胞的获得比mES晚了整整17年。 1998年，美国威斯康星大学麦迪逊分校的James Thomson和约翰•霍普金斯大学医学院的Shamblott等首先分别从人ICM(Inner Cell Mass，内细胞团) 和PGCs (Primordial germ cells，原始生殖细胞）成功地建立了hES 细胞系[21, 22]，从而开启了对hES的科研和临床研究。

依培养mES的经验，在最初hES细胞的培养体系中也加入了hLIF以抑制hES的分化。但结果与预期的相悖，即hLIF无法维持hES细胞的未分化状态。原因何在？

最初，人们推测hLIF不能抑制hES分化的原因是hES细胞表面缺乏hLIF的受体[23]。但美国加州大学圣地亚哥分校(UCSD)的Rohan Humphrey于2004年证实hES细胞上存在hLIF的受体，且hLIF与hES上的受体结合后可以激活JAK/STAT信号传导途径[24]。理论上如果JAK/STAT3信号传导途径被激活了，应该与hLIF或mLIF作用于mES相似，hES也应该保持未分化状态。但结果确是，hES仍然会分化。所以该文作者认为，hES细胞的分化状态与hLIF是否激活hES细胞的JAK/STAT3信号传导途径无关。

其实，不单是hES，LIF对猴(rhesus monkey)和兔(Rabbit)的ES也无效[25, 26]。问题是，什么因子可抑制这些种属ES(包括人、猴和兔的ES)的分化呢？答案是FGF-basic，即碱性成纤维细胞生长因子，又称FGF-2。文献[26-29]对FGF-basic在维持这些ES细胞未分化状态中的作用进行了详述。

附录

mES(小鼠胚胎干细胞)的维持培养液 (有饲养层培养) (以配制500ml mES培养液为例。按下表配制，配制后，4oC可储存2周)
组分	贮存液浓度	终浓度	终体积
DMEM培养液(高糖)	100%		410 ml
FBS(胎牛血清)	100%	15%	75 ml
L-谷氨酰胺	200 mM	2 mM	5 ml
非必需氨基酸(NEAA)	10 mM	0.1 mM	5 ml
丙酮酸钠	100 mM	1 mM	5 ml
b-巯基乙醇	14.3 M	0.1 mM	3.5 ml
LIF	50mg/ml	10 ng/ml	0.1 ml
注：mES对FBS的质量非常敏感，请务必使用ES细胞验证过的FBS

mES(小鼠胚胎干细胞)的维持培养液 (有饲养层培养) (以配制500ml mES培养液为例。按下表配制，配制后，4oC可储存2周)
组分	贮存液浓度	终浓度	终体积
DMEM-F12培养液	100%		390 ml
KOSR(血清替代物)	100%	20%	100 ml
L-谷氨酰胺	200 mM	2 mM	5 ml
非必需氨基酸(NEAA)	10 mM	0.1 mM	5 ml
b-巯基乙醇	14.3 M	0.1 mM	3.5 ml
FGF-basic	20 mg/ml	4 ng/ml	0.1 ml

hES(人胚胎干细胞)的维持培养液（无饲养层培养）

为保证培养的最佳效果，最好使用商品化的hES无饲养层培养液，如PeproTech公司的PeproGrow-ESC人胚胎干细胞培养液，其优点为：
● 世界上唯一不含酚红(phenol red)和胰岛素(insulin)的人胚胎干细胞无饲养层培养液。(酚红会影响活细胞成像，并可能因具有潜在的雌激素作用而影响胚胎干细胞的正常功能[30,31]，而培养基中的胰岛素则会干扰对由胚胎干细胞分化而成的胰岛素分泌细胞的检测)

● 含高品质的重组生长因子(FGF-basic和TGF-b1等)

● 极具竞争力的价格

● 细胞铺板率高

● 与美国Rutgers(罗格斯)大学干细胞培训中心合作开发，并在该中心的培训教程中使用

PeproGrow-hESC 胚胎干细胞培养液
PeproGrow-hESC	产品编号：BM-hESC	500mL	2800元
PeproGrow-hESC	产品编号：BM-hESC	100mL	1120元
应用范围：用于体外，不能用于诊断或治疗