目前，药用抗体的研发主要基于杂交瘤细胞或者体外抗体库。通过抗原设计和抗体筛选，人们初步获得阳性的hits，再进一步通过一系列生物性质检测和功能验证，终得到有药用潜力的抗体。在实际研发过程中，经过了常规筛选所得的抗体，有诸多方面需要更细致的改进，包括亲和力、免疫原性、半衰期等等，抗体领域这些年来做了很多相关的研究和实践。其中，抗体亲和力成熟是研究的重要方向之一。理论上，抗体亲和力的提高有助于改善抗体的特异性和效力，有助于减少用药剂量，降低毒副作用等。虽然实际的研究证明亲和力的提高与抗体效价的提高并不总是线性的关系，尤其在实体瘤的治疗上（可参考Weinstein的“binding site barrier”假说[1]），但很多情况下，这个线性关系是明显存在的。另外，发展抗体亲和力成熟的技术，不仅有助于抗体药物的研发和质量改善，同时也有助于人们更好地理解抗体与靶点相互作用的机理，更好地认识靶点的功能。

抗体亲和力主要技术包括如下几项：

1. 模拟体细胞高频突变的抗体亲和力成熟策略

BCR基因重排后的成熟B细胞受到抗原刺激后，会于生发中心发生重链和轻链V区的高频率突变（主要是点突变），之后再经过FDC捕获抗原使表达高亲和力BCR的B细胞免于凋亡。这一过程使得后代B细胞的BCR对抗原的平均亲和力得到提升。这样的体细胞高频突变属于二次免疫应答，帮助可有效识别抗原的抗体进一步成熟，有助于机体有效抵抗外来抗原的再次入侵。

抗体亲和力成熟的策略之一，就是模拟体细胞高频突变，通过细胞突变和展示抗体蛋白筛选对抗原高亲和的抗体。原理如下图：

1.1 基于B细胞系（人、鸡等）高频突变的筛选策略

Ramos是来源于人Burkitt淋巴瘤的一株细胞系，在培养过程中其重排后的免疫球蛋白V区基因持续发生组成型突变，并表达到膜表面。早在2002年Sarah等人就报道了利用Ramos细胞系筛选出对链霉亲和素有高亲和力的IgM。将链霉亲和素结合到磁珠上，从一群Ramos细胞中筛出对链霉亲和素有低亲和力的细胞群，之后降低磁珠上的链霉亲和素的密度以提高筛选的标准，进一步筛出亲和力更高的突变。之后又进一步用标记FITC荧光的链霉亲和素结合流式分选将抗体亲和力进一步提高。

随后，他们对各批次的亚克隆细胞的V区基因做了序列比对，找出了突变位点，分析了抗体与靶点之间的构效关系。

同在这篇文章中，他们还尝试了使用XRCC2缺失的鸡来源的B细胞系（DT40），筛选针对多个抗原的高亲和力IgM。该细胞系同样具有高频率的V区基因组成型突变，并且比Ramos细胞系增殖时间更短。筛选结果显示该细胞系也能实现IgM的亲和力成熟。

以上两个例子说明合适的B细胞系可以作为工具细胞，用于抗体的亲和力成熟。在具体应用中，可以将特定的抗体模板基因插到细胞的免疫球蛋白基因位点，然后进行细胞培养和高亲和力细胞群的筛选。

1.2 基于其他细胞高频突变的策略研究

基于体细胞高频突变的抗体亲和力成熟的开发，主流方法均是基于B细胞系。B细胞系有其自身的不足，如基因操作比较困难、蛋白的翻译后修饰特点不能满足所有外源蛋白的要求等等。于是有实验室尝试在非B细胞系统上实现亲和筛选，以扩充该技术的细胞系选择面。

如中科院生物物理所杭海英课题组，向人非小细胞肺癌细胞系H1299中导入激活诱导的胞苷脱氨酶（AID），构建H1299-AID稳转株，然后进一步导入抗TNF-α的scFv基因并构建稳转株，得到的稳转株进行培养和流式分选，获取高亲和力的scFv。

除此之外，还有基于非真核系统的筛选方法，如利用E. Coli的基因增变株来实现抗体基因的高频突变等等，其原理大同小异。

2. 基于抗体库的亲和力成熟策略

基于抗体库的抗体亲和力成熟与基于抗体库的抗体筛选并无本质差别，均为体外高亲和力抗体筛选，重点仍是两个方面，即库的构建和筛选系统的选择。区别在于，后者所用的库在构建或合成时无偏向性或只具有针对某抗原的有限的偏向性；而前者所用的库是基于确定的抗体序列模板所构建的。

2.1 建库策略

建库的策略可分为两个大的类别：一类是构建较大的库，将抗体CDR区域甚至整个V区做随机突变；另一类是构建较小的库，将突变集中于抗体序列上特定的区域。

大库构建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段随机突变并保证相邻两个突变区域有所重叠，从而使突变覆盖整个CDR区域；chain shuffling是将抗体的VH和VL的配对重新洗牌，而DNA shuffling则是将抗体V区的序列重新洗牌。在DNA shuffling中，突变不限于CDR区，也包括FR区域，因为FR区域对于抗体与抗原的结合也可能有所贡献。这些方法所构建的库的容量较大，工作量也较大。

相比大库的构建，小库构建更有序列针对性。在没有其他信息的情况下，人们习惯优先选择对抗体重链CDR3区域进行随机突变，因为重链CDR3区域被认为通常对抗原抗体结合起关键作用；但若要真正提高亲和力优化的效率，还需要更多的信息以帮助人们找出更精确的突变区域。

目前突变区域的选择主要是基于抗原抗体复合物的结构信息或胚系基因热点（germline hotspots）的预测。

1）基于抗原抗体复合物的结构信息的突变区域选择

当抗体抗原复合物的结构被解析之后，我们就可以得知两者相互作用的位点信息，进而进行更精确的突变和建库。

MorphoSys AG2016年发的文章介绍了他们提高其自身的抗人GM-CSF抗体MOR103的亲和力的工作。他们在知悉该抗体与抗原的结合方式后，对抗体的CDR-H2和CDR-L3分别做随机突变，并用噬菌体展示的方法筛选到高亲和力的序列，之后再把筛到的重链与轻链配对，得到一个新的“cross-cloned”抗体:

体外GM-CSF和GM-CSFR结合的抑制实验比较了这4个抗体的效价。另外，他们还分别解析了这4个抗体与GM-CSF结合的复合物的结构并进行比较，探讨了构效关系。

2）基于胚系基因热点（germline hotspots）的突变区域选择

Germline hotspots是体细胞高频突变过程中的优先突变区域，几乎都处于CDR区域内部，经证明对抗体的亲和力提高起到关键作用，因此体外亲和力成熟时可优先考虑抗体的germlinehotspots。

具体的做法是利用数据库来比对抗体的序列和抗体胚系基因序列，结合序列相似度和RGYW motifs等坐标性的序列预测出germline hotspots，然后在这些热点位置进行突变，构建小的库进行筛选。早在2009年，Ira Pastan课题组就发表protocol，以抗CD22的单抗为例，利用germline hotspots预测和噬菌体展示技术提高抗体的亲和力[5]。

至于引入突变的方法，较简单的是易错PCR，但很难达到好的突变效果。另外一种比较流行的就是在引物上设计突变，即人工合成带有突变区域的引物库。具体的设计方法有很多，包括控制突变碱基的数目、控制每个位点各种碱基出现的概率等，以此来满足对库的容量和偏向性的需求。

2.2 筛选方法

基于库的抗体亲和力成熟与基于库的抗体初步筛选涉及的方法基本相同，主要是利用噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示等系统。

酵母展示技术

噬菌体展示的优势在于操作方便，流程相对简易；

酵母展示的优势在于与流式分选相结合，检测和筛选同时进行；

核糖体展示的优势是系统容量较大，可用于大库的筛选，另外可以实现库的体外进化。这些技术各有优劣，根据实际需要选择使用。

技术介绍：

根据抗体亲合力成熟的原理，在体外抗体亲和力成熟的过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前突变策略主要分三类：随机突变，随机突变，置换和定向突变。

易错PCR：

易错PCR是目前常用的抗体突变技术，可以在抗体基因的全场或部分区域随机引入突变；在聚合酶对目的基因扩增时；通过调整反应条件以及使用错错配率高的聚合酶等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，经过PCR反复进行进行随机诱变，累计突变效应，终获得目的蛋白的随机蛋白突变体。

链置换：

保留某个特定抗体的轻链或重链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株。通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库。随机组合有可能产生合适链组合，通过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的抗体。

定点突变：

由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的CDR区，在抗体的亲和力体外成熟过程中，CDR去是常选用的定点突变区域，这样既可以获得足够的祖列多样性，又不会破坏蛋白质结构，对CDR进行定点突变时，可以对多个CDR进行平行突变或者逐步进行优化。

DNA改组：

DNA改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核苷酸酶Ⅰ将其切割成不超过50bp的片段，再随机组合后进行PCR扩增成完整的抗体基因的技术，包含了抗体片段随机化切割重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体亲和力成熟的过程，并加快了体外定向进化速度。

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参考文献:

[1]Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: directexperimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research.

[2]Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitrousing hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology.

[3]Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFv with somatic hypermutation innon-B cells. Protein Cell.

[4]Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolutionof a neutralizing anti-human GM-CSF antibody.

[5]In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. MethodsMolBiol